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拟南芥的种植、转化和筛选
作者:管理员    发布于:2015-04-13 10:29:04    文字:【】【】【

1:拟南芥的种植

试剂配制

人工土:3份蛭石,1份珍珠岩和1份黑土混合

PNS营养液:

每升含

5ml 1M KNO3,

2ml 1M Ca(NO3)2˙4H2O,

2ml 1M MgSO4˙7H2O,

2.5ml 20mM  Fe.EDTA, 

2.5ml 1M磷酸缓冲液(pH5.5),

1ml MS 微量元素 。

PNS营养液母液配方

①1M    KNO3  101.1g

②1M    Ca(NO3)2˙4H2O    236.15 g

③1M    MgSO4˙7H2O,246.48 g

④20mM  Fe.EDTA:     

FeSO4       5.57g             

EDTA        7.45g

注意先各自配成溶液,在混合。 

⑤1M磷酸缓冲液(pH5.5):

磷酸二氢钾    130.4g 

磷酸氢二钾    9.12g

⑥MS 微量元素 

硼酸                     0.434g 

硫酸锰(MnSO4 H2O)     1.7626g

CuSO4˙H2O                0.0798g 

ZnSO4˙7H2O               0.172g 

NaMoO4˙2H2O             0.0432g 

NaCl                     0.585g 

CoCl˙6H2O                0.00129g 

以上母液均配至1L

种植步骤

将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中,并用保鲜膜罩上。两天后光照,三天后揭膜。

人工培养室条件:相对湿度80%,恒温20-240C,光照强度80-200umol/M2/S,光照周期为8 h黑暗﹑16 h光照培养。

2 :拟南芥的转化

试剂配制

渗透培养基(一升中):1/2xMurashige-Skoog;5% 蔗糖;0.5克 MES;用KOH调至pH5.7;再加:10微升1mg/ml的6-BA 母液;200微升Silwet L-77)

注意:6-BA 母液配制时用乙醇溶解。1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本组分配制,但大量元素减半。

另:经转化的拟南芥,种子收获后需在相应的抗性平板上筛选转化子

转化步骤

(1) 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml,在转化前一天晚上,转入大瓶培养过夜,第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。

(2) 室温5000rpm离心15分钟。

(3) 弃上清,将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里,使O.D600在0.8左右。

(4) 将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株(或用抽真空的方法),盖上透明的塑料盖子或保鲜膜以保持湿度,移入恒温室避光培养,第二天可开盖,正常光照培养。

(5) 一周后再喷洒一次,方法同上。

3 转化子的筛选

(1) 种子消毒:先用70%乙醇浸泡10分钟,在上述处理时要不时地使种子悬浮;然后用无菌水洗四次,在这步处理时最好也不时地使种子悬浮。

注意:用乙醇浸泡的时间不宜过长!

(2) 处理后的种子用Top agar(0.1%琼脂水溶液)均匀涂布在固体筛选培养基表面。一块150mm直径的平皿最多种1500棵。

(3) 4℃春化2到3天,移入22℃恒温室培养。

(4) 观察种子在固体筛选培养基上生长情况,可确定为转化子时,将转化子移栽至浇过饱和PNS营养液的人工土壤培养。

脚注信息
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